产品目录

本试剂盒的是基于本公司BalbScript第一链cDNA合成预混液和SYBR qPCR SuperMix进行研发生产，具有高灵敏度，高效合成能力和扩增效率。该试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板，用BalbScript第一链cDNA合成预混液进行反转录，用SYBR qPCR SuperMix进行荧光定量。本制品配有不同浓度的ROX Reference Dye，用于不同仪器校正孔间荧光信号误差。

• 用DEPC处理实验用到的所有实验器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，实验过程戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
  
• 确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
  
• 试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子要确保扣严。
  
• 纯化过的RNA必须保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
  
• 为保证反转录反应的有效进行，需使用高质量的RNA模板。

• 第一链cDNA合成
  融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
  
  • 按顺序加入以下反应物：
    

    成分	用量
    模板RNA	总RNA(0.1ng～5μg) poly(A) mRNA(10pg) 特异性RNA(0.01pg)
    2×BalbScript 1st cDNA SuperMix	10μL
    RNase Free Water	至20μL

  • 如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后，65℃孵育5分钟，冰上冷却，再加入其它组分。
    
  • 轻轻混匀，离心。42℃孵育15～30分钟。如果RNA模板中不含poly A结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育15～30分钟。反应产物可直接用于PCR，如果不立即使用，-20℃保存少于一周，长时间保存建议-70℃放置。
• 实时定量
  合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50μL的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2μL。
  
  • 常用反应体系
    

    成分	用量
    2×SYBR qPCR SuperMix	10μL
    上游引物	0.2～1.0μM(终浓度)
    下游引物	0.2～1.0μM(终浓度)
    模板	1～2μL
    RNase Free Water	至20μL

  • 常用PCR循环
    两步法可获得高特异性，三步法可获得高扩增效率，根据需要选择不同的扩增程序。
    
    • 两步法扩增程序：
      

      温度	时间	循环数
      94℃	5min	1
      95℃	15s	35～40
      60℃	1min

    • 三步法PCR扩增程序：
      

      温度	时间	循环数
      94℃	5min	1
      95℃	15s	35～40
      50～60℃	20s
      72℃	30s

• ROX I校准的Real Time PCR仪有：
  ABI 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast;
  ABI StepOne/StepOnePlus及其他仪器。
  
• 用ROX II校准的Real Time PCR仪有：
  ABI 7500/7500 Fast；ABI ViiA7;ABI Q6;ABI Quant Studio 6/7 Flex;
  Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P及其他仪器。
  
• 不需要用ROX校准的Real Time PCR仪有：
  Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/iQ/My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon/Chromo4；
  Eppendorf MasterCyclerrealplex/realplex 2s。
  Cepheid SmartCycler；Illumina Eco qPCR；
  Roche Applied Science LightCycler 480；
  Thermo Scientific PikoReal Cycler；
  Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/Rotor-Gene 6000及其他仪器。